Panduan Troubleshooting Kit ELISA: Solusi & Cara Mengatasi Masalah Lab
Updated: Sep 30
Instruksi kit ELISA sudah dipelajari, persiapan pengujian (pengkondisian instrumen, pengkondisian kit, sampel, dan reagen) telah dilakukan, dan proses pengujian telah mengikuti manual. Meski demikian saat menunggu hasil pembacaan OD (optical density) rasa cemas seringkali muncul. Ini adalah hal yang lazim dirasakan analis ketika melakukan pengujian ELISA. Menjelang hasil keluar, wajar jika seorang analis kerap dibayangi berbagai pertanyaan di kepala (“Apakah kurva standar nya nanti linear?”, “Apakah recovery bagus?”, “Apakah sampel blangko benar-benar bersih dari kontaminasi?”, “Apakah pemipetan sudah presisi (dinyatakan sebagai %CV, singkatan dari coefficient of variation)?”.
Kekhawatiran-kekhawatiran semacam ini perlahan akan mereda seiring dengan bertambahnya jam terbang dan pemahaman terhadap karakter kit yang digunakan. Kuncinya terletak pada kebiasaan mengenali pola masalah dan mengetahui langkah yang harus diambil saat kendala terjadi. Dalam artikel ini, akan dibahas berbagai permasalahan teknis yang sering muncul saat melakukan pengujian dengan kit ELISA, penyebab, serta solusi praktis untuk mengatasinya. Kendala-kendala teknis yang ada di artikel ini adalah rangkuman selama penulis melakukan berbagai trial kit ELISA yang mungkin tidak selalu ditemukan secara generik di halaman web produsen-produsen kit ELISA.
Kontaminasi Silang saat Uji ELISA Malachite Green: Sebaiknya tidak Menggunakan Bolpoin Biru dan Hitam.
Malachite Green (MG) adalah pewarna organik yang digunakan untuk industri tekstil, walaupun secara historis digunakan juga sebagai bahan antimikroba pada akuakultur. Malachite green dan turunannya (leucomalachite green/LMG) adalah zat karsinogenik yang dapat menyebabkan kanker karena mampu memutasi DNA. Penggunaannya untuk produk akuakultur dilarang di banyak negara, termasuk Amerika Serikat, Kanada, China, dan Uni Eropa. Tahap preparasi sampel untuk ELISA Malachite Green sangat rentan terhadap kontaminasi terutama dari tinta (terutama yang berbahan dasar minyak) biru dan hitam pada bolpoin, sehingga disarankan untuk memakai bolpoin merah saat melakukan preparasi sampel (tinta hitam dan biru umumnya memakai senyawa fenil yang mirip MG (MG adalah golongan senyawa trifenilmetana), sedangkan tinta merah umumnya memakai eter glikol dan alkohol). (1, 2)
Standar Beku-Kering (Lyophilized) yang Higroskopis Mudah Rusak oleh Uap Air di Udara.
 |  |
Masalah lain yang muncul pada kit ELISA adalah integritas reference standard. Reference standard padat yang bersifat higroskopis (mudah menyerap uap air) seperti pada standar/kontrol positif senyawa nitrofuran, harus selalu disimpan dalam plastik wrap tertutup dan disertai desiccant atau silica gel. Standar yang sudah menyerap uap air dapat menyebabkan galat sistematis karena mengubah konsentrasi awalnya. Saat pengujian, disarankan untuk segera memasukkan kembali stok standar yang tidak terpakai ke dalam wadahnya (standar ini sensitif terhadap cahaya dan suhu, sehingga harus segera disimpan di wadah dan kulkas). Bentuk standar yang sudah menyerap air dapat terlihat seperti pada gambar kanan di atas, tampak seperti meleleh, sedangkan standar yang masih bagus tampak seperti pada gambar kiri. Standar yang sudah menyerap air juga menyebabkan stabilitasnya turun sehingga lebih cepat mengalami degradasi (terutama karena hidrolisis) bahkan sebelum melewati masa kadaluarsa.(3, 4)
Spiking Sample untuk Memverifikasi Performa Kit ELISA
Saat memakai kit ELISA terkadang kita ingin membuktikan metode yang digunakan pada kit dapat menghasilkan data yang akurat dan konsisten. Akurat dalam artian kit tersebut menghasilkan data kadar analit di dalam sampel sesuai dengan jumlah yang sebenarnya, sedangkan konsisten dalam artian hasil dari beberapa pengujian selalu menghasilkan data yang mirip untuk konsentrasi yang sama. Cara terbaik melakukan hal ini biasanya dengan membandingkan hasil analisis satu sampel memakai kit ELISA dan sampel yang sama diuji dengan metode referensi (metode yang sudah diketahui sumber galatnya), biasanya menggunakan teknik kromatografi (GC-MS, HPLC, atau LC-MS).(5) Namun menggunakan metode-metode ini sebagai pembanding untuk membuktikan akurasi dan keterulangan (reproducibility) kit ELISA sangat tidak efisien, bahkan biayanya dapat jauh melampaui harga kit ELISA itu sendiri.
Cara sederhana yang bisa dilakukan pengguna adalah dengan membuat spiking sample. Spiking sample adalah penambahan sejumlah kontrol positif analit ke dalam matriks sampel yang konsentrasinya diketahui secara pasti untuk menguji apakah metode pengujian yang digunakan mampu mendeteksi analit dengan akurat. Spiking biasanya dilakukan saat tahap awal preparasi sampel, misalnya pada sampel padat seperti produk akuakultur, penambahan kontrol positif dilakukan setelah penimbangan sampel. Sampel yang sudah ditambahkan (di-spike) kontrol ini kemudian melalui proses preparasi atau ekstraksi sesuai dengan metode kit ELISA. Kadar analit kemudian dihitung dengan ELISA dan setelah dikurangi blangko (sampel tanpa spiking, untuk mengetahui background sinyal dari matriks) kadar analit ini kemudian dibandingkan dengan kadar analit yang diharapkan atau kadar analit teoritis, sehingga diperoleh persentase perolehan kembali (%recovery). Kriteria penerimaan % recovery ELISA adalah sekitar 80% - 120%.(6)
Sample spiking berguna untuk proses validasi atau verifikasi metode ELISA, memverifikasi LOD yang tercantum di kit, menguji keterulangan (repeatability), mengevaluasi efek matriks, dan bisa juga digunakan sebagai kontrol internal (atau kontrol positif) saat menjalankan pengujian. Besarnya konsentrasi kontrol positif yang digunakan untuk spiking bisa berapa pun selama masih dalam rentang kurva kalibrasi (tidak kurang dari LOD dan tidak lebih dari konsentrasi standar tertinggi). Keberadaan spiking sample selama proses pengujian ELISA membantu mempermudah penelusuran jika terjadi masalah saat pengujian.(5)
Masalah-Masalah yang Muncul jika Memakai Kit ELISA Kadaluarsa
Kit ELISA yang telah kadaluarsa biasanya menghasilkan kurva standar yang tidak linear (satu atau beberapa level konsentrasi standar menghasilkan OD sangat tinggi atau sangat rendah), gradien OD yang kacau (normalnya OD semakin naik atau semakin turun secara konsisten seiring dengan urutan tingkat konsentrasi standar, namun jika OD naik turun tanpa memiliki pola atau bahkan tidak ada perubahan OD yang signifikan, maka gradien dikatakan kacau), atau efisiensi ekstraksi yang kecil (recovery rendah). Laju degradasi atau kerusakan setiap reagen dalam kit ELISA bisa berbeda-beda, umumnya antibodi dan enzim lebih cepat dan lebih mudah mengalami degradasi karena lebih sensitif terhadap faktor lingkungan seperti cahaya, suhu, atau oksigen.(7) Keduanya adalah reagen biologis (protein) yang aktivitasnya bergantung pada bentuk molekulnya. Adapun substrate solution (misal TMB) sangat sensitif terhadap cahaya, terutama sinar ultraviolet atau cahaya matahari. Reagen-reagen inilah yang biasanya menentukan masa kadaluarsa kit (produsen mengkajinya melalui uji stabilitas). Stop solution biasanya terbuat dari senyawa asam (HCl, H2SO4, dll) sehingga lebih tahan lama dibandingkan reagen lain.(8)
Emulsi yang Terbentuk Selama Ekstraksi dapat Dicegah dengan Pemanasan, Sentrifugasi, dan Memodifikasi Proses Vorteks
Pembentukan emulsi saat ekstraksi sampel juga dapat mempengaruhi recovery analit. Pembentukan emulsi terjadi ketika dua jenis cairan yang tidak saling bercampur (seperti lemak dan air) disatukan, interaksi keduanya kemudian dijembatani oleh bahan pengemulsi. Dalam konteks ekstraksi sampel, peran pengemulsi ini umumnya berasal dari komponen alami matriks sampel (misalnya protein). Dalam konteks ekstraksi sampel, bahan pengemulsi ini umumnya berasal dari komponen alami matriks sampel (misalnya protein). (9, 10)
Pada proses ekstraksi residu antibiotik dalam jaringan hewan, emulsi biasanya terbentuk antara fase organik (misal n-heksana) dengan fase aqueous di mana analit larut. Emulsi seringkali terbentuk saat proses vorteks yang agresif. Emulsi berpotensi mempengaruhi akurasi pengujian jika terdapat banyak analit yang terjebak di dalam emulsi. Untuk menghindari terbentuk banyak emulsi, vorteks dapat dilakukan dengan kecepatan yang lambat dan diselingi dengan jeda. Hal ini biasanya dilakukan misalnya saat proses preparasi sampel untuk ELISA kloramfenikol, saat pencampuran n-heksana dengan sample diluent, vorteks dilakukan pada kecepatan rendah selama 30 detik, diiringi jeda selama 10 detik, ulangi vorteks lagi selama 30 detik, kemudian jeda lagi 10 detik.
Proses ini diulangi sebanyak 4 - 5 kali. Dengan cara ini larutan menjadi homogen tanpa menghasilkan banyak emulsi. Pemanasan pada suhu 80oC selama 5 menit diikuti dengan sentrifugasi pada 4000xg selama 5 menit juga dapat menghilangkan emulsi, terutama saat proses preparasi sampel nitrofuran. Pada sampel dengan emulsifikasi yang sangat banyak, setelah proses sentrifugasi seringkali fase aqueous masih terlihat agak kekuningan, hal ini menunjukkan fase aqueous masih mengandung sedikit lemak sehingga penambahan n-heksana dan sentrifugasi perlu diulangi. Penambahan n-heksana yang kedua kali ini biasanya menghilangkan emulsi. Mendiamkan sampel di suhu ruang selama 30 menit setelah proses vorteks juga membantu menghilangkan emulsi. Sementara penambahan senyawa asam atau garam konsentrasi tinggi tidak disarankan karena ada potensi mengganggu reaksi antigen-antibodi ELISA.
Proses Vorteks untuk Volume Sampel yang Besar lebih Mudah Menggunakan Tabung Sentrifus 50 mL
Saat bekerja dengan volume larutan atau sampel yang besar (10 mL atau lebih) sebaiknya menggunakan tabung sentrifus 50 mL alih-alih 15 mL. Tabung 15 mL yang terisi hampir penuh menyisakan hanya sedikit ruang kosong (headspace) sehingga larutan cenderung bertahan di bawah, bergerak lambat tanpa membentuk pusaran. Hal ini mengakibatkan proses pencampuran menjadi kurang homogen. Hal ini akan diperparah jika sampel yang digunakan adalah jaringan (misal, daging udang atau produk akuakultur lain) yang sebelumnya telah dibekukan atau teksturnya lengket sehingga cenderung membentuk agregat. Sampel jaringan ini akan bergerak sangat lambat dan susah tersebar merata di dalam tabung sehingga sampel tidak terdispersi secara sempurna yang mengakibatkan ekstraksi senyawa analit kurang efisien. Hal ini akan menghasilkan recovery yang rendah.(11)
 |  |
Larutan dengan volume 8 mL di dalam tabung sentrifus 15 mL lebih susah membentuk aliran vorteks. | Volume larutan yang sama di dalam tabung sentrifus 50 mL lebih mudah membentuk vorteks sehingga sampel lebih terdispersi dan teraduk secara rata. |
Substrate Solution yang tidak Menghasilkan Warna Bisa Terjadi karena Salah Pencampuran atau Kerusakan Kit
Salah satu human error yang sering membuat panik saat proses ELISA berlangsung adalah salah memasukkan reagen ke dalam well. Hal ini sebenarnya dapat dicegah jika analis memberikan label pada tabung dan memperhatikan langkah kerja dengan seksama. Namun, jika memang reagen yang salah sudah terlanjur masuk ke dalam well, proses analisa sebenarnya masih bisa dilanjutkan tanpa mengulangi dari awal dengan well yang baru, asalkan hal ini langsung disadari detik itu juga dan belum memasuki tahap inkubasi. Saat hal ini terjadi, segera buang larutan di dalam well, lakukan pencucian sekali dengan washing buffer untuk memastikan tidak ada reagen yang tertinggal, kemudian keringkan microplate dengan tisu bersih. Tambahkan kembali reagen yang benar.
Contohnya pada saat melakukan ELISA oxytetracycline, substrate solution A dan substrate solution B seharusnya dicampur dengan volume yang sama sebelum dipipet ke dalam well. Pencampuran dua kali 1 mL substrate solution A alih-alih 1 mL substrate solution A dan 1 mL substrate solution B membuat sampel tidak menghasilkan warna (Seharusnya tidak sampai satu menit hingga standard 1 menunjukkan perubahan warna menjadi biru, ELISA oxytetracycline ini adalah ELISA kompetitif, sehingga standar 1 yang memiliki kadar analit terendah, yaitu 0 ppb, memiliki OD tertinggi, atau warna paling pekat). Setelah menyadari kejanggalan dengan pembentukan warnanya, dilakukan uji dengan cara mencampur 25 µL substrate solution A dengan 25 µL substrate solution B dan 25 µL enzyme conjugate. Hasilnya campuran tersebut masih menunjukkan perubahan warna biru pekat yang menunjukkan reagen masih dalam kondisi baik, sehingga dapat disimpulkan kesalahannya terjadi pada saat pencampuran substrate solution A dan substrate solution B. Selanjutnya larutan di dalam microplate dibuang dan dilanjutkan dengan pencucian satu kali dengan washing solution, lalu analisa dilanjutkan kembali dengan penambahan substrate solution A dan substrate solution B (kali ini dengan campuran reagen yang benar). Hasilnya recovery dari sample spike masih dalam kriteria penerimaan (101% dan 120%) meskipun ada kendala tersebut.
 |  |
Tidak ada perubahan warna di dalam well setelah penambahan substrat TMB. | Saat dilakukan pencampuran antara substrate solution A, substrate solution B, dan enzyme conjugate hasilnya ada perubahan warna, hal ini menunjukkan reagen kit dalam kondisi baik dan masalah terdapat pada pencampuran substrate solution A dan substrate solution B. |
Sampel Kering Hasil Evaporasi Umumnya tidak Bertahan Lebih dari 24 Jam
Saat melakukan preparasi sampel ELISA kadang terdapat tahapan yang memiliki waktu yang tidak pasti seperti saat evaporasi dengan nitrogen. Waktu yang diperlukan untuk tahap ini tergantung dari seberapa tinggi suhu yang dipakai, seberapa cepat aliran nitrogen untuk menguapkan sampel, dan karakteristik pelarutnya. Untuk tahapan yang sifatnya semacam ini, sangat disarankan untuk melakukan analisa sedini mungkin di jam kerja (terutama jika tidak familiar dengan proses pengujiannya) untuk menghindari kendala-kendala yang akan menyita banyak waktu di tahap ini, misalnya evaporasi yang terlalu lama. Jika produsen kit mematok suhu evaporasi dalam rentang (misal 50-70oC), maka sebaiknya pilih suhu tertinggi untuk memastikan kita tidak membuang banyak waktu di tahap evaporasi sehingga harus lembur. Namun, jika tahap evaporasi tetap memakan waktu yang lama (misalnya karena jumlah sampel banyak dan keterbatasan lubang rak sampel, sehingga proses evaporasi tidak dilakukan secara simultan untuk semua sampel) dan tidak ada waktu untuk lembur, maka sebaiknya proses preparasi sampel dijeda setelah tahap ini selesai.
Analit dalam sampel kering cenderung lebih stabil daripada analit yang larut dalam pelarut (reaksi kimia lebih mudah terjadi dalam medium cair atau pelarut, sebagaimana besi lebih mudah berkarat jika terendam air).(12) Sampel yang sudah benar-benar kering kemudian ditutup rapat dan disimpan di suhu 2-8oC kondisi gelap (atau memakai aluminium foil) untuk kemudian dilanjutkan prosesnya di hari berikutnya. Penting dicatat, untuk memastikan sampel masih dalam kondisi baik, penyimpanan sebaiknya tidak lebih dari 24 jam. Semakin lama penyimpanan dilakukan, semakin besar kemungkinan sampel rusak, baik karena oksidasi, paparan cahaya, atau fluktuasi suhu kulkas yang mungkin tidak disadari.
Kesimpulan
Banyak masalah dalam ELISA bukan secara langsung disebabkan oleh kerusakan kit, melainkan oleh faktor-faktor yang sebenarnya dapat dikendalikan. Kondisi penyimpanan reagen dan standar, teknik preparasi sampel, pemilihan consumables yang tepat, dan ketelitian dalam mengikuti urutan langkah kerja. Pemahaman terhadap prinsip kerja ELISA, bukan sekedar mengikuti protokol, adalah kunci untuk mendiagnosis masalah dan mengambil keputusan yang tepat saat terjadi kendala.
Dokumentasi setiap kejadian di luar kebiasaan selama pengujian akan membantu membangun pemahaman terhadap cara kerja kit dan penanganan masalahnya. Beberapa penanganan masalah yang saya jelaskan tersebut mungkin terlihat seperti tidak mematuhi kaidah GLP (Good Laboratory Practice), terutama hal-hal teknis di luar yang tertulis di instruksi manual. Akan tetapi hal ini tetap berguna jika tenggat waktu untuk analisa sangat terbatas dan hasil pengujian yang akurat diperlukan untuk segera membuat keputusan di lapangan. Lagi pula, implementasi GLP yang baik bukan berarti setiap prosedur berjalan sempurna tanpa penyimpangan atau kesalahan, melainkan setiap penyimpangan atau kesalahan beserta penanganannya tetap didokumentasikan untuk menjaga ketertelusuran. Walaupun demikian kami tetap menyarankan agar pengguna tetap mengikuti prosedur di dalam manual instruksi yang tersedia dan setiap kendala teknis didiskusikan dengan supplier atau produsen kit.
Referensi
US Patent No : US 6,398,441 B1.
EU Patent Application No : EP 1 219 689 A1
Pitriani P, et al. 2026. Protection of Hygroscopic Pharmaceutical and Nutraceutical Active Ingredients via Film Coating Technologies: A Review. Drug Des Devel Ther. doi: 10.2147/DDDT.S562981.
Liu Han Ng, et al. 2022. Formulation strategies to improve the stability and handling of oral solid dosage forms of highly hygroscopic pharmaceuticals and nutraceuticals. Pharmaceutics. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14102015.
Wild David, et al. 2013. The Immunoassay Handbook, Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques (Fourth Edition). Amsterdam : Elsevier.
ICH Q2(R2). Validation Of Analytical Procedures. 24 March 2022.
Kolosova AY, et al. 2005. Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1. stabilization of ELISA kit components and application to grain samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. (384) : 286–294.
Tijssen P. 1985. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Amsterdam : Elsevier.
Knipe CL. 2014. Emulsion, type of sausage. Encyclopedia of Meat Sciences. (3) : 256-261. doi:10.1016/B978-0-12-384731-7.00143-4
Knipe CL. Meat Emulsion. Proceedings of the Eighth Annual Sausage and Processed Meats Short Course. ISU Extension Service CE 2113.
Seunggi Choi, et al. 2025. Effects of diameter and aspect ratios on particle separation efficiency in hydrocyclones. Processes. 13(12). https://doi.org/10.3390/pr13123980
Sinex S, et al. 2026. Chem 2000 : General Chemistry for Engineering. Davis, California : LibreTexts libraries.
